专业：农业资源与环境
姓名：李佳怡
实验报告学号：_J6
实验报告
日期：
地点：生物实验中心310
课程名称：生物化学实验（丙） 实验名称：蔗糖酶的提取
一、实验目的和要求（必填）
三、实验材料与试剂（必填）
五、操作方法和实验步骤（必填）
七、实验结果与分析（必填）
.指导老师：方祥年 成绩:_
_同组学生姓名：金宇尊、鲍其琛
二、实验内容和原理（必填） 四、实验器材与仪器（必填） 六、实验数据记录和处理 八、讨论、心得
一、实验目的和要求
1、 学习掌握蔗糖酶的提取、分离纯化的基本原理和方法;
2、 巩固理论知识，学会学以致用并发现新问题。
二、实验内容和原理
订 1、实验内容:
线 蔗糖酶的提取、分离纯化
2、实验原理:
酵母细胞破碎
细胞破碎的常用方法液体剪切法―超声波法.机械搅拌法.高压匀浆法
细胞破碎的常用方法
固体剪切法一压力和研磨
非机械法——> 物理法.化学渗透法.酶溶
本实验采用研磨的方法。通过固体剪切法（研磨）将酵母细胞破碎，把蔗糖酶从酵母细胞中提取岀 来。
蔗糖酶的初步分离纯化
蛋白酶常用的初步分离纯化方法有：盐析、选择性变性、有机溶剂沉淀等。
本实验采用选择性变性（加热）、有机溶剂（乙醇）沉淀等方法对蔗糖酶进行初步的提纯以及收集 样品。
由于一般酶蛋白在常温下分离纯化过程中易变性失活，为了能获得尽可能高的产率和纯度，在提纯 操作中要始终保持酶的活性，如在低温下操作等，这样才能得到较好地分离提纯效果。
三、实验材料与试剂
1、实验材料
市售干酵母粉10g/组（3?4人）
2、实验试剂
石英砂，95%乙醇（-20*0,20mmol/L Tris-HCl 缓冲液。
四、实验器材与仪器
电子天平（称量干酵母粉）：研碎（每组一套）：50ml高速离心管（4支/组、4孔50ml离心管架一 个/组）；托盘天平（离心管平衡用）：高速冷冻离心机：恒温水浴箱（50°C）；量筒（50ml）、微量 移液枪（lOOOu 1）及枪头或移液管（1ml）、玻棒、滴管等;离心管（留样品I、II用）及离心管架：制 冰机：一20°C冰箱。
五、操作方法和实验步骤
1、 酵母细胞破粹（干磨法）
称量：称取市售干酵母粉10計约3-5 g石英砂放入研钵
研磨（干磨）：至尽可能成细粉末状（约15min）
加液+研磨：呈:取总体积40 ml的20mmol几Tris-HCl缓冲液，分2次加研磨lOmin,
使呈糊状液体；
离心：将糊状液体转移到2支50ml离心管中，两支离心管平衡后（托盘天平上），离心lOmin
（条件:4°C、12000r/min）
收集+测量：收集上淸液并量出体积VI （样品I）,另留1ml上淸液（样品I ）放置一20°C冰箱保存
用于蔗糖酶蛋白含量测眾、蔗糖酶活力测定和SDS分析
2、 热处理
水浴热处理：将上步抽提液（样品I）,迅速放入50°C恒温水浴，保温30min,
并每隔5min用玻璃棒温和搅拌提取液。
冰浴冷却：保温后迅速用冰浴冷却5min
离心：将热处理后的样品I转移至两支50ml离心管中，平衡后，离心10mina
（条件：4°C, 12000r/min）
收集+测量：收集上淸液并量出体积V2 （样品II）,另留1ml上淸液（样品II ）放宜一20°C冰箱保存
（用于蔗糖酶蛋白含量测左、测左蔗糖酶活力和SDS分析。
3、 有机溶剂（乙醇）沉淀
冰浴：将热处理后的上淸液加入相同体枳的一20°C的95%乙醇，冰浴中温和搅动混匀，
放置约20min：
离心：转移至两支50 ml离心管中，平衡后，离心lOmin：
（条件:4°C, 12000r/min）
收集保存：弃去上淸液，用7 mL的20mmol/L Tris-HCl缓冲液溶解沉淀
留岀lmL溶液，并将余下溶液转移入7 mL塑料离心管，一20°C冰箱保存。
（用于实验2离子交换柱层析分离纯化蔗糖酶）
六、 实验数据记录和处理
1、 实验数据记录
石英砂：：
干酵母粉:；
Tris-HCl提取离心后上淸液体积（样品I ） VI：：
样品I热处理离心后上层淸液体积（样品II）V2：。
2、 实验现象：
研磨过程：干酵母颜色变浅，散发岀一股难闻的气味：
第一次离心后：上清液澄淸颜色上黄色；下部沉淀分层，上层酵母细胞碎片等呈棕褐色，
下层石英砂呈白色：
第二次离心后：上清液更加澄淸橙黄色；沉淀为米白色，较第一次变浅：
第三次离心前：上晴液柠檬黄，沉淀为米白色。
七、 实验结果分析讨论
1、 实验结果：
经过研磨破碎的酵母提取液样品I （lmL）：
将样品I经过热处理的样品II （lmL）：
经过选择性变形和有机溶剂沉淀处理过的样品II,用Tris-HCl缓冲液溶解保存在一只7mL和一只 lmL的离心管中（样品III、IV）。
注意：所有收集样品均需在管壁外用油性记号笔做好标记，先放在一次性PE手套中，并放入-20 *C冰 箱中保存，用于后续实验。
2、 结果分析：
①最后得到的两管沉淀，英中一管为米白色沉淀，另一管夹杂部分黄色沉淀，疑为杂质蛋白，或是由于 在加入乙醇时体积比例没有调整好而造成，具体结果有待进一步检测。
②误差分析:
a：称呈:天平精确度不高，可能会对石英砂和干酵母的称量结果造成误差；
b：在研磨过程中，有少部分粉末洒岀，存在操作误差；
c：在平衡过程中，为了保持平衡用胶头滴管在两支离心管之间进行调肖，有部分溶液残留在胶头滴管 里。可以将所有的材料放进一支离心管，另外一支离心管加入水，通过改变水的含捲达到平衡的效果， 以此来减少误差。
八、讨论、心得
1、 实验原理探析
石英砂的作用：加入石英砂是为了在研磨过程中增大摩擦力，将酵母细胞充分研磨破裂，提取蔗糖酶:
高温水浴：利用了蔗糖酶的耐热性（最受温度为45-50°C）,可以在50°C的水浴热处理下将不耐热的 杂蛋白去除：
有机沉淀：乙醇提供疏水的环境，破除蛋白质外层的水膜，从而使提取的蔗糖酶聚集在一起沉淀分离;
冰浴作用：使分子运动速度下降，再加以搅拌使之快速沉降。
低温操作：防I匕操作过程温度升髙引起有效成分变性。
2、 思考题：本实验在从丁?酵母中提取和分离纯化蔗糖酶的过程中具体运用了哪些方法你认为还有哪些 方法可以运用说说你的设想。
答：①在本次试验中采用机械法中固体剪切法的研磨法：分离纯化过程用了选择性变性（加热）、有机 溶剂（乙醇）沉淀的方法，后通过离心达到真正分离纯化的目的。
②英他常用细胞破碎方法：液体剪切法中的超声波法、机械搅拌法、高压匀浆法以及固体剪切法中的压 力法和非机械法中的溶胀和自溶、化学渗透和生物酶降解等。由于蔗糖酶存在于细胞内部，所以需要将 细胞破碎以获取蔗糖酶。另外，浓缩方法有沉淀法、吸附法、超过滤法、透析法、减压蒸懈法、冰冻干 燥法等。
不同的方法都各有优势和缺点，我们要根据不同的实验条件和要求、目的来选择较为适宜的方法。（《生 物化学技术原理及应用》赵永芳第四版）
3、 实验感想
第一次做生化实验，感觉还是很新鲜。在实验开始研磨的过程中，就有点被一股难闻的味道恶心到了。
之后在实验具体操作过程中，发现实验本身比较简单，所以即使第一次实验没有预习，还是能够很快的 理解实验的内容。但是之后的实验应该还是比较复杂的，所以需要我们好好预习，并进行一定的思考， 以便在下次实验课上能充分的将理论课上所学知识应用到实验中去。
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