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大学
研究生学位论文开题报告
及论文工作实施计划
院（系、所） 临床医学院
学科（专业） 科学
研究生姓名
学位门类与学位级别 医学硕士
导师姓名
入学年 月
开题报告日期
2003年12月制表
填表须知
1、 论文开题报告由研究生本人向审议小组报告并听取意见后，在指导教师或有关教师指导下填写此 表。
2、 博士生应在入学后第二学期结束前、硕士生应在第三学期结束前完成此开题报告。研究生院培养 与学籍管理办公室收到此开题报告至少半年后才予受理答辩申请，因迟交开题报告影响答辩而超过学制规 定年限，由研究生本人负责；
3、 研究生开题前宜填写查新报告。查新报告对理、工、医、管等学科博士生作为必要环节。博士生 查新工作可委托图书馆负责，也可在完成网络文献检索类研究生课程的学习或参加学校组织的网络文献检 索培训后，自行组织查新检索，自行组织查新需要详细文献查新述评作为附件。自行查新报告须经导师审
查后由开题报告审核专家组审核签字 （或盖章）。硕士生和文科博士生开题查新参考上述办法，不作硬性要
求。
4、 本表一式两份，一份研究生自留放入本人“研究生档案材料袋” ；一份由院（系、所）保存并归入院 （系、所）研究生教学档案。
5、 学位门类与学位级别指的是工学 （或理学等）博士、硕士。
6、 本表下载区：。本表电子文档打印时用 A4纸张，格式不变，内容较多是可以加页。
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、学位论文开题报告
论文
题目
SE对发冃期大鼠学习记忆、胆碱冃匕糸统影响及丹参十预的头验研究
研究
神经心理
方向
题目
国家
部委
省
市
厂、矿
自选
有无合同
经费数
备注
来源
题目
理论
应用
工程
跨学科
其他
类型
研究
研究
技术
研究
论文开题
图书
图书馆有关部门签字（或盖章）
前上网检
馆负
索情况（硕
责查
士牛可不作
新
要求；理、
研究
开设网络检索课程
（或讲座）的教师
工、医、管
签字：
学科博士生
生自
应填写查新
行查
报告）
新
年 月曰
开题报告内容
一.立题依据
癫痫是由多种原因引起的脑功能障碍综合征，是脑细胞群异常超同步化放电引起的突发 性、暂时性、发作性脑功能紊乱。世界上癫痫患者超过 5%o。癫痫的起病与年龄密切相关，儿 童期是癫痫高发年龄段，我国的调查表明：1岁以内起病患儿占小儿癫痫总数的29.0% 7岁以 内起病患儿占总数的82.2%说明小儿癫痫多发生于学龄前期，即使成年癫痫，起病年龄 15岁
以下者也接近50%学习记忆是中枢高级神经精神活动的重要功能之一， 是人及动物赖以生存
的最基本的神经精神活动。影响癫痫患儿学习记忆功能的主要因素为：癫痫基础病因、临床 发作类型、癫痫发病年龄、癫痫发作频率及持续时间、癫痫控制情况及抗癫痫药本身对认知 功能的影响。大量研究证实，癫痫发作尤以癫痫持续状态 (status epilepticus, SE)，不仅可引起
暂时性脑功能障碍，且可致严重的器质性脑损伤，进而引起学习记忆及行为异常等严重后果。
动物实验研究认为，SE对大鼠的情感记忆有近期影响 ⑴，SE可使大鼠学习记忆功能受损 ⑵，但 机制仍无法完全阐明。SE致学习记忆受损己成为神经领域关注的热点问题。
SE导致脑损伤主要表现为海马CA3区、齿状回神经元线粒体体积缩小，基质浓缩，嵴模 糊不清.并出现空泡、畸形，同时可见高尔基复合体轻-中度扩张等形态学改变，最终出现神 经元丢失、胶质细胞浸入病变神经元周围；以及细胞凋亡的形态学变化［3］。近来有研究证实SE 后鼠脑海马区树突的分枝和密度降低 ⑷齿状回可见苔鲜样纤维发芽［5］。SE发作后脑神经元的 损伤有一动态变化过程⑹。发作后4h, SE动物即有部分神经元变性，继之出现神经元坏死的病 理学特征，于发作后2-3天达高峰。发作后7天，变性坏死减轻，主要见神经元丢失后遗留的
“空穴”，胶质细胞浸入病变神经元周围和神经元脱失区，而锥体层神经元减少。
长期以来人们一直认为SE过程中伴有的缺氧缺血是选择性神经元损伤的主要原因 ⑺。然
而近年动物实验研究证实，选择性损伤神经元的分布与癫痫活动的传播密切相关。 Holmes等
⑹证实SE发作后的神经元丢失是过度兴奋的结果。发作导致神经元的大量去极化而致谷氨酸 过度释放，进而引起一系列的生化级联反应导致神经元损伤或死亡。同时仅有痫性放电但无 惊厥行为发作的动物及患者，同样发生惊厥性脑损伤 ［9-10］。这些现象均证实SE中的神经元损
伤，除与脑缺氧缺血有关外，主要还与皮层细胞过度兴奋和放电有关 ⑹。尚有研究者认为苔
鲜纤维发芽导致“苔鲜纤维-颗粒细胞树突”兴奋性突触环路的形成 ［5］，然而目前对苔鲜纤
维发芽的机制尚不完全清楚，其也有可能是代偿性的和有利的。
未成熟脑惊厥阈值低，对惊厥刺激敏感性高。以相当于婴儿期和成年期 Wistar大鼠为对
象，发现在相同致惊剂量下，在成年鼠多诱发局限性惊厥或短暂全身发作，而在幼龄鼠则引 发全身痉挛性SE发作，与临床小儿时期更易出现癫痫持续状态发作等特征相同 ［11］。未成熟脑
的这种敏感性与多种生理因素有关，特别是与其皮层神经元功能发育不全，较弱刺激也能在 大脑引起强烈兴奋与扩散，致使神经细胞容易大量异常放电，同时神经髓鞘发育也不成熟、 冲动易于泛化有关［12］。然而未成熟脑对SE致脑损伤具有更强的耐受性。未成熟脑在相同条件 下所出现的脑损伤程度远较成熟脑轻，同时未成熟脑似乎比成熟脑更能抵抗谷氨酸的兴奋毒 性［13］。经历相同时间相同类型的痫样发作，发育期脑苔鲜纤维发芽比成年脑较不突出 ［14］。但
幼鼠的这种抵抗力是不完全的［15］。这种相对抵抗力被认为是与活化突触的低密度、低能量消 耗和导致细胞死亡的生化级联反应相对不成熟有关 ［16］。有研究［17］发现幼鼠脑内凋亡抑制基因
bc1-2和具有细胞保护功能的热休克蛋白(HSP70)明显增高，而成年鼠脑内却有凋亡诱导基因 P53的持续高表达，表明幼龄鼠脑内确实存在一个主动的神经元保护机制，但究竟在 SE中，
幼年机体通过何种分子调控手段来实现这种神经元保护作用，还有待进一步深入研究。
癫痫引发记忆障碍的具体机制目前仍不甚清楚。与记忆相关的脑结构的损伤可能是原 因之一。然而，并非所有伴有记忆损害的癫痫患者都有脑组织的形态学改变。而且这些结 构性损害的严重程度与记忆损害之间缺乏直接联系的证据。因此其他因素，如神经化学改 变，可能在癫痫发作后记忆功能损害方面具重要作用。乙酰胆碱 (Ach)是一种研究较早的
中枢神经递质，对中枢神经系统(CNS)似乎有兴奋和抑制双重作用，以兴奋为主。神经末梢 胞浆中的胆碱和乙酰辅酶 A在胆碱乙酰化酶(AchT)的作用下生成Ach，并进入囊泡贮存。
AchT是Ach合成的限速酶。在钙离子的参与下，囊泡与突触前膜相融合，释放 Ach至突
触间隙。然后Ach作用于突出后膜的Ach受体，介导信息的传递，并参与多种生理功能的 完成。当和受体分开后，就迅速被突触间隙内的乙酰胆碱酯酶 (AchE)降解为胆碱和乙酸。
徐格林等证实在大鼠发育期诱导癫痫发作可损害大鼠的空间认知能力 ，而出生前后胆碱
补充可以减轻这种损害[18]。Serram等报道PTZ点燃使自由活动的大鼠海马中乙酰胆碱含 量下降至对照组的52%，并维持这水平达4周，至停止PTZ注射后30天恢复至对照组水 平[19]。
丹参系唇形科鼠尾草属植物丹参(Salvia miltiorrhiza Bge)的根及茎，经现代工艺提取的 丹参化学成分包括丹参酮I、丹参酮U a、丹参酮U b,隐丹参酮及原儿茶醛、丹参素、丹 参酸乙等。现代药理研究证实丹参具有改善缺血再灌注损伤， 调节免疫，降低血液粘稠度，
改善微循环的作用，改善脑损伤造成的远期认知功能障碍，本课题旨在从组织、细胞水平 探讨丹参对SE诱发的发育期幼鼠记忆损伤是否具有保护作用，以便为临床探索一种有效治 疗SE致记忆损伤提供理论依据。
总之，本研究以戊四氮(PTZ)诱导发作的SE发育期大鼠模型为研究对象，探讨了 SE对 发育期大鼠学习、记忆等认知功能的影响；采用丫迷宫和旷野试验对大鼠癫痫发作后情感和 认知功能进行评定；采用免疫组织化学法探讨大脑海马中 ChAT、AChE水平在癫痫发作后认 知功能损害过程中可能发挥的作用；采用比色法对癫痫发作后脑内ChAT、AChE的活性进行 测定，分析SE发作后认知功能损害与这两种酶活性的关系；探讨了发育阶段SE对脑内胆碱 能系统的影响及其与认知功能的相关关系；从预防和治疗的角度出发，评估丹参对SE发作 和对认知功能可能具有的良性作用，并对其神经化学机制进行了初步分析。
【参考文献】
Erdoga n F , Golgeli A , Arma n F , et al . The effects of pen tyle netetrazole in duced status epilepticus on behavior , emoti onal memory , and lear ning in rats [J ] . Epilepsy & Behav , 2004 ,5 :388 -393.
娄燕，王维平，王晓鹏等.持续癫痫大鼠行为学和神经肽YmRNA表达的改变.基础医学 与临床.2005, 255 (7): 662-666.
吕晓明，高旭光，刘芳.铿-匹罗卡品致痛幼鼠海马结构损伤的形态学及苔藓纤维发芽研
究.中国临床神经科学.2002;10(1):9-12.
Choe nfeld J, Seide nberg M, Woodard A, et al. Neuropsychological and behavioral status of childre n with complex partial seizures. Dev Med Child Neurol 1999； 41: 724-731.
Mello LE, Covalan L. Spontaneous seizures prefentially injury interneurous in the pilocarpine model of chronic spontan eous seizures.Epilepsy Res,1996,26: 123-129.
⑹蒋莉，蔡方成，张晓萍，不同成熟期大脑对持续惊厥的耐受性 .中华儿科杂志2002,
40(7) :429-432.
Moshe SL. Brain injury with prolonged seizures in children and adults. J Child Neurol, 1998, 13suppl:3-6.
Shin C, Lee KH. Epilepsy and cell death. In: Koliatsos VE, Ratan RR ets.Cell death and Diseases of the Neuron System. New Jersey: Huma na Press, 1999,361-378.
B one RC. Treatme nt of conv ulsive status epilepticus. Recomme ndati ons of the Epilepsy
Fou ndation of American Worki ng Group on Status Epilepsy.JAMA,1993,270:854-859
Marks JD, Friedman JE, Haddad GG. Vul nerability of CA, neuro ns to glutamate is developme ntally regulated. Brain Res Dev Brain Res 1996; 97:194-206.
Liu 乙 Stafstrom CE, Sarkisian M, et al. Age-dependent efects of glutamate toxicity in the hippocampus. Brain Res Dev Brain Res 1996; 97:178-184.
Holmes GL,Be n-Ari Y. The n eurobiology and con seque nces of epilepsy in the develop ing brain. Pediatr Res,2001;49:320-325.
Degiorgio CM, Correale JP, Gott PS, et al. Serum neuron-specific enolase in human status epileptics. Neurology, 1995;45:1134-1137.
Ta nabe T, Suzuki S, Hara K, et al. Cerebrosp inal fluid and serum neuron-specific eno lase levels after febrile seizures. Epilepsia,2001;42 ⑷:504-507.
Rab ino wicz AL, Correale J, Boutros RB. Neuron-specific eno lase is in creased after si ngle seizures during inpatient video/EEG monitoring.Epilepsia,1996;37:122-125.
Zerr 1, Zerr 1, Bodemer M, et al. Cerebrospinal fluid concentration of neuron-specific eno lase in diag nosis of Cren tzfeldt-Jakob disease. La ncet,1995;345:1609-1612.
Degiorgio CM, Gott PS, Rabinowiez AL, et al. Neuron-specific enolase, a marker of acute neuronal injury, is in creased in complex partial status epilepticus. Epilcpsia,1996;37:606-609
徐格林，黄远桂，苗丹民等?大鼠出生前后胆碱补充对癫痫发作后认知功能的影响. J
Apop lexy and N ervous D iseases,April 2003, l 20(2) 146-148.
Serram M, Dazzil L, Pisu MG, et al. Reversal of a selective decrease in hippocampal acetylcholi ne release, but n ot of the persiste nce of kin dli ng,after disc on ti nu ati on of Ion g-term pentylenetetrazol administration in rats [J]. Brain Res, 1997, 751 (1): 175-179
二、研究方法与技术路线：
研究目标、研究内容和拟解决的关键问题
研究内容：
1采用国内外公认的经典建模药物 PTZ建立SE模型，丹参对SE大鼠进行干预；
2观察各组大鼠的行为学，予拒俘反应性、开场实验检测大鼠情感，利用水迷宫、 丫 迷宫检测学习记忆能力，脑电图检测脑神经元放电；
3利用HE染色比较各组大鼠脑海马组织病理变化；
4利用免疫组织化学法检测脑海马组织各区 ChAT、AChE的表达的改变，比色法检
测 ChAT、AchE 活性；
5探讨丹参对SE发作及学习记忆的干预效果及对胆碱能系统的影响。
研究目标：
本研究拟采用PTZ建立SE大鼠模型，探讨SE对发育期大鼠情感、学习记忆、脑神 经元放电的影响及其与胆碱能系统的关系，并探讨丹参改善胆碱能系统功能及治疗 SE、改
善情感学习的神经保护机制，从多层面探索，为临床药物治疗 SE致记忆损伤提供理论依
据。
拟解决的关键冋题：
?建立大鼠SE模型，利用丹参对SE模型进行干预，测定在疾病模型状态下发育期大
鼠行为、情感、学习记忆的改变，以及脑电活动的改变。
?利用病理学实验方法检测大鼠海马组织病理变化。
?利用免疫组织化学技术结合比色法对海马组织中 ChAT、AChE的表达进行定性及
半定量分析。
拟采取的研究方法、技术路线、实验方案及可行性分析
技术路线与实验方案
1实验动物选取及分组：6周龄清洁级雄性SD大鼠，90只，随机分为生理盐水对照 组（18只）和造模组（72只）
建立动物模型：PTZ（Sigma公司）溶于生理盐水，形成浓度为1% （10mg/ml）的溶 液，用前2小时新鲜配制，应用PTZ40 mg/ kg对SD大鼠腹腔注射,10 min后注射20 mg/ kg, 然后每10 min注射10 mg/ kg ,直至达到足够强度和SE持续发作。生理盐水对照组（NG 组）大鼠腹腔注射同等容量相同次数的生理盐水。
SE标准：按Simialowski 6级评定法评定惊厥发作，即：0级，无惊厥发作；I级，点头， 眨眼，颈动或湿狗样颤抖；U级，节律性点头；川级，头部抽搐加前肢颤抖；W级，第川级 加后肢站立；V级，惊厥致跌倒，全身强直性抽搐V级发作即为全身性惊厥大发作， 持续30分钟及以上者为本组惊厥持续状态（全身痉挛性癫痫持续状态）模型。
模型组分亚组：
丁 A组：SE组（36只）。
気B组：丹参干预组（36只）。
惊厥终止发作后半小时丹参干预组腹腔注射复方丹参注射液 10g/kg，每隔24h重复给等
量药一次。其余两组按同样方法给予等量生理盐水，各组动物混合饲养，每日测量体重调 整注射剂量，直至不同时间（惊厥后即刻,10d,30c）随机分批进行情感学习检测后处死。
3 .情感学习记忆的检测：
拒俘反应性：以动物从未接触过的手套轻抓癫痫大鼠，观察其反应。记分标准：很容 易抓取动物0分；尖叫或回避1分；尖叫并回避2分；逃脱3分；逃脱并尖叫4分；咬或试图 撕咬手套5分；主动跃起攻击6分。
开场实验：开场实验箱为75cm x 75cm x 50cm的正方形无盖的箱子,内壁漆黑,在底 部有白线划分的15cm x 15cm大小的格子，共25个格，在开场箱的上方用一个100W的日 光灯照明。动物放在这个箱底的最中央的一个小方格中,用10cm x 10cm x 10cm大小的不 透光的暗黑色盒子盖住大鼠，待30秒后，将盒子轻轻移开。采用双盲法，由两位观察者，分 别观察大鼠2分钟内方格穿行格数（三爪以上跨入邻格的次数）、中央格内停留时间、竖立 次数（两前肢离地1cm以上）、理毛次数和粪便粒数。每只动物每次实验结束后要用浸有酒 精的布将地面擦拭干净。
Morris水迷宫：本次Morris水迷宫实验的程序包括：（1） 定位航行实验（place
navigation tas? :用于测量大鼠对水迷宫学习和记忆的能力。实验历时 5天，每天分上、下
午2个时段,共9个时段,每时段训练4次。训练时随机选择一个象限（本实验选择SW）开 始,按逆时针方向，将大鼠从各象限边缘中点位臵面向池壁放入水中，观察并记录在120秒 内找到平台的时间（逃避潜伏期,escape latency。大鼠的运动策略分为4种：直线式、 趋向式、边缘式和随机式，观察并记录9个时段的训练期间大鼠每次寻找站台所需的潜伏 期和采用的策略。如果大鼠在120s内未能找到平台则人为引导至平台停留10秒后移开， 潜伏期记为120秒；隐匿平台逃避潜伏期反映动物空间记忆的获得情况 ，即空间学习记忆
能力。（2）空间搜索实验（spatialprobe test）：用于测量大鼠学会寻找平台后，对平台空间位 臵记忆的能力。即在第5天的第5次训练时撤除平台，然后任选一个入水点（本实验选择 SW）将大鼠面向池壁放入水中,由摄像系统及电脑路径软件自动记录大鼠120秒内:（1） 动物在目标象限（原平台所在象限target quadra nt）运动时间；（2）在站台周边区域1（与站台 距离小于水池半径1/2的区域）、11（与站台距离小于水池半径的区域）、山（与站台距离大 于水池半径的区域）内停留时间的长短；（3）穿越目标（原平台位臵）次数。
丫迷宫：用于大鼠学习记忆的研究。由3个相同的臂组成，分别称为I区、U区、川区。
通常把下臂（I臂）定为起步区，左侧（U臂）为安全区，右侧（川臂）为电击区，三臂相交处 为隔离区（0区）。迷宫底铺以铜棒，可以通电刺激。三臂顶端各装有 15W勺信号灯。将小鼠
放入三臂等长丫迷宫的某一支臂，大鼠受电击后以起步区直接逃到有灯光的安全区为“正 确反应”，逃到有灯光安全区后停止通电；若逃到无灯光区的另一侧臂则为“错误反应”， 大鼠继续遭受电击。再以大鼠所在臂为下一次实验起点。开始训练时，大鼠受电击逃离起 步区后可能跑向非安全区，并在电击作用下最终才跑至安全区 （被动回避反应），故会出现
错误反应；多次训练后，安全区灯亮，电刺激尚未开始时，大鼠立即逃往安全区，即为形 成明暗辨别条件反射（主动回避反应）。用随机不休息法，测大鼠的明暗辨别条件反射（主 动回避反应），电刺激参数为：电压50伏，延时5秒。明暗辨别条件反射训练学习一天，记 忆一天,每只大鼠记录训练10次的逃避时间和逃避达标反应次数，每次间隔时间 15 S,按
下式计算逃避达标反应率，以反映大鼠学习能力 ：逃避达标率（％）=逃避达标反应次数/训 练次数（10次）X 100%。
4.行为学观察结束后灌注取材
普通病理切片取材：左心室插管，快速灌注生理盐水100ml后用40g/l多聚甲醛400ml 灌注固定，剪开颅骨，取嗅球后 5mm至小脑之间的脑组织，放入 40g/l多聚甲醛后固 定过夜，再移入0.3g/l的蔗糖溶液中4C过夜。冰冻冠状切片，挑取海马组织切片做普 通HE染色和ChAT、AChE免疫组织化学染色。染色后分别对海马门区、CA1区、CA3 区的ChAT、AChE免疫反应阳性细胞进行计数。
4.统计学处理：实验数据以平均值 琳准差（x± s）表示，数据处理采用 SPSS 10.0 统计软件，组间差异显著性采用ANOVA单因素方差分析，相关性采用spearman等 级相关分析。
［附实验流程图］
可行性分析
医学院图书馆馆藏资源丰富，能完成实验资料检索
本研究项目组已经掌握戊四氮致癫痫动物模型的建立、学习记忆能力测试、大鼠 免疫组化等实验方法。
本院中心实验室有实验所需设备及部分试剂，本院神经生物学研究室拥有实验所 需的实验设备。
有学院相关学科的技术支持和协助。
目前国内有可靠的试剂盒可供本实验检测使用
课题研究的学术和应用价值
丹参能改善SE所致学习记忆能力低下，有利于开发改善 SE所致智力障碍的治疗药 物；
丹参易于通过血脑屏障，有利于发挥药效；
丹参是祖国传统药材，来源广，给药方便，具有副作用少、价格低廉等优点。
本课题的创新之处：
SE致发育期大鼠学习记忆能力低下国内外报道少见
大鼠SE发作与学习记忆及ChAT、AChE表达的关系国内外尚无报道
丹参治疗SE所致发育期大鼠学习记忆能力低下国内外未见报道
5、预期结果
本课题通过动物实验研究能获得如下结果：
SE发作导致发育期大鼠学习、记忆等认知功能低下的影响 ；
大脑海马中ChAT、AChE水平在SE发作后认知功能损害过程中可能发挥作用
丹参对SE发作和对认知功能可能具有的良性作用；
研究结果将撰写论文，预期在本专科核心期刊上发表论文 1-2篇。
6、主要研究人员
硕士研究生
科研设计进行实验撰写论文
教授
指导科研设计组织实施
7、经费预算
合计
8000 元
科研业务费
1000 元
实验材料费
2000 元
试剂费
4000 元
其他
1000 元
研究生签名：
年 月曰
、学位论文工作实施计划
（一）论文的理论分析与硬件要求及其应达到的水平与结果
1探讨SE大鼠学习记忆改变的病理结构基础和其他相关因素；
2、证实丹参能改善癫痫大鼠的学习记忆障碍，并初步探讨其机制
（二）论文工作进度与安排
起讫
日期
工作内容和要求
备注
查阅相关文献资料，了解国内外研究现状及实验的方法、原
理、技术路线
收集资料，进行预实验
完成正式实验
撰写论文
开 题 报 告 审 议 情 况 记 录
1、 审议小组成员（审议小组成员应不少于5人）:
组长：
成员：
2、 审议小组意见
3、 票表决结果
审议小组出席 人；通过 人；不通过 人。
4、 审议小组组长（签名）
审议小组成员（签名）
年 月 日
指导教师对开题报告的综合意见
指导教师（签名）
年 月 日
教研（研究）室（或学科点）意见：
教研（研究）室主任（或学科负责人）签名（或印章）
年 月
院（系、所）意见（对博士研究生需填写此栏）:
院（系、所）负责人签名（或印章）
年 月 日
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