黄酮 标准曲线绘制的实验报告
总黄酮的测定
实验仪器 电子天平 AR2140; 紫外可见分光光度计 UV2754; 型数控超声波清洗器 KQ3200DB; 超级恒温槽 ;
Rotavapor R200 旋转蒸发仪 ;
FD21C250冷冻干燥机2
试剂及药品
芦丁 标准品
硝酸铝 国产分析纯(配成 5 %)
亚硝酸钠 国产分析纯(配成 10 %)
氢氧化钠 国产分析纯配成(配成 1 mol/L )
95%乙醇,无水乙醇 国产分析纯(配成 60%乙醇 50%乙醇)
DPPH( 2, 2-diphenyl-1-picrylhydrazyl ,二苯代苦味肼基自由基)
Vc (Ascrobic acid ,维生素C,抗坏血酸) 没食子酸对照品:基准纯。
大青叶子 采摘于海南大学东坡湖畔
实验步骤:
准备工作及波长的确定
样品60C烘干粉碎机粉碎,过20目筛,装入试剂瓶中备用。根据查阅文献 总黄酮在波长为510nm处吸收值最大。
参照品芦丁标准溶液的制备
精密称取120 C干燥至恒重的芦丁标准样品 37.5mg置于100mL烧杯中,用 60%乙醇溶解后定容至25mL容量瓶中,摇匀,即可得1.5mg/mL的芦丁标准溶液。
标准品的测量及绘制标准曲线
精密吸取芦丁标准溶液 0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL ,分别置于
10mL 容量瓶中,并定容至刻度线。得到 0.0mg/ml、0.15mg/ml、0.3mg/ml、 0.45mg/ml、0.6mg/ml、0.75mg/ml、0.9mg/ml 的标准品溶液,分别取 1ml 至U试 管中各加5 %亚硝酸钠溶液0.3mL摇匀,放置6min ,加10%硝酸铝溶液0.3mL摇 匀,放置6min ,加1mol /L氢氧化钠溶液4mL ,再用60%S醇溶液稀释至刻度,放 置15min后,分别在510nm处测定其吸光度(Tai,Cai&Dai,2011 )。(以试剂空白 做参比)
以吸光度A为纵坐标,浓度c为横坐标,绘制标准曲线。用最小二乘法进行 线性拟合,得c与A的线性回归方程以及相关系数 氏。
序号
浓度(ug/ml)
吸光度
1
0
0
2
15
0.180
3
30
0.349
4
45
0.546
5
60
0.727
6
75
0.884
7
90
1.063
表1-1 : 芦丁标准曲线测定数据
y = 0.0113x^0.0023
R"2 = 0.沁—
0 1 1 1 ' '
0 50 40 ED SO LOO
Rutin concentraiiontis/iil)
图1-2:芦丁标准曲线
135样品的测试
根据查阅文献总黄酮在波长为 510 nm处吸收值最大。取黄酮提取液, 取提
液2ml至10ml的比色管中用60%勺乙醇定容至刻度线则稀释 5倍。取稀释好的 溶液4份1ml置入10ml的比色管中,其中一份用60%勺乙醇定容,作为参比溶 液。其余各份各加5灿硝酸钠溶液0.3mL摇匀,放置6min ,加10%肖酸铝溶液 0.3mL摇匀,放置6min ,加1mol氢氧化钠溶液4mL,再用60%S醇溶液稀释至刻 度,放置15min后,分别在510nm处测定其吸光度。代入标准曲线回归方程可得浓 度数据(以芦丁为参比) , 三次结果取平均值。经换算后得样品中总黄酮含量
样品总黄酮含量 (mg/g)=X*n*V 1/( V *W)
式中:X—测出的浓度,mg/mL;(直接代入,不用换算。)
n—稀释倍数,量纲为1;
VI —样液总体积, mL;
V—测定时取样体积,mL;
W—样品质量,g。
总分含量的测定
实验仪器
ALZO4型电子分析天平:上海梅特勒一托利多仪器有限公司;
DELA犯0型pH计:上海梅特勒一托利多仪器有限公司; 723可见分光光度计 :上海菩华科技仪器有限公司 ;
DK一 512型电热恒温水浴锅:上海森信实验仪器有限公司;
容量瓶(250mL, 10OmL 25mL)、比色管管(10mL);
烧杯、移液管、吸耳球。
试剂及药品
没食子酸对照品:基准纯,购于上海分析试剂厂,置 50 r真空干燥箱真
空中干燥 4 h 。乙醇为工业级,蒸馏水,其他试剂均为分析纯。
Folin — Ciocalteu 比色法测定总酚酸含量
Folin —Ciocalteu 试剂的配制
称取20 g钨酸钠和5 g钼酸钠于圆底烧瓶中,用140 ml蒸馏水溶解,加入10ml 85%的磷酸溶液和20 ml浓盐酸,文火回流10 h,然后加入3 g硫酸锂及15 ml双 氧水,加热沸腾15 min至亮黄色,不得带微蓝和绿色。冷却,移入 250 ml容量瓶 中,定容,贮于棕色瓶中,4 r冰箱保存。
对照品溶液制备
准确称取15. 00 mg干燥的没食子酸,加蒸馏水适量,超声溶解,放冷,以 蒸馏水定容至50ml,制成0.3mg/mL没食子酸的溶液,作为对照品溶液。
将0.3mg/mL的没食子酸标准溶液分别配制成 0.0mg/mL,0.03mg/mL, 0.06mg/mL, 0.09mg/mL, 0.12mg/mL,0.15mg/mL、0.18mg/mL、0.21mg/mL的溶液, 分别取1m置于10m的容量瓶中,加入2 ml福林试剂,充分摇匀,加入0.75ml 7.5 %
碳酸钠溶液?混匀,以蒸馏水稀释至刻度。振荡一下,静置 2h(Guo&Wei,2011)。
同时制作空白管。为消除供试品溶液本身颜色的干扰,同时制作不加显色剂的对 照管。于765 nm波长处测定吸光度值。
2.3.3标准曲线的制备
以吸光度A为纵坐标,浓度c为横坐标,绘制标准曲线。用最小二乘法进行 线性拟合,得c与A的线性回归方程以及相关系数 氏。
序号
浓度
(ug/ml)
吸光度(WL765.0
0
0
0
1
3
0.132
2
6
0.284
3
9
0.411
4
12
0.582
5
15
0.712
6
18
0.843
7
21
1.013
表3-1 :没食子酸标准曲线测定数据
图3-1 :没食子酸标准曲线
2.3.4样品的测定
取提液2ml至10ml的比色管中用60%勺乙醇定容至刻度线则稀释 5倍。取 稀释后溶液1ml四份,分别置于10mL比色管中,加入2 ml福林试剂,充分摇匀, 加入0. 75ml 7.5 %碳酸钠溶液.混匀,以蒸馏水稀释至刻度。振荡一下,静置 2h。同时制作空白管。为消除供试品溶液本身颜色的干扰, 同时制作不加显色剂 的对照管。于765 nm波长处测定吸光度值。
总酚酸含量计算:
多酚含量(mg/100g)X(mg)
多酚含量(mg/100g)
X(mg)稀释倍数
0.5总酚酸称样量(g)
100
清除DPPH?的能力的测定
3.1.实验仪器、药品及试剂
实验仪器
ALZO4型电子分析天平:上海梅特勒一托利多仪器有限公司;
DELA犯O型pH计:上海梅特勒一托利多仪器有限公司;
723可见分光光度计:上海菩华科技仪器有限公司;
DK — 512型电热恒温水浴锅:上海森信实验仪器有限公司;
容量瓶(250mL, 10OmL 25mL)、比色管(10mL);
烧杯、移液管、吸耳球。
试剂及药品
DPPH( 2, 2-diphenyl-1-picrylhydrazyl ,二苯代苦味肼基自由基);
Vc (Ascrobic acid ,维生素C,抗坏血酸)为分析纯;
无水乙醇,蒸馏水
配希9 DPPHW
配制0.06mMDPP试剂,放入冰箱4 C进行冷藏,以备用。
3.2.2参照品Vc标准溶液的制备
准确称取17.6mgVc到100mL的烧杯中用无水乙醇溶解后, 置于50mL的容量 瓶中定容至刻度线及可以得到 2mmol/L的母液,分别量1、2、3、4、5、6ml至 10ml的比色管中用无水乙醇定容至刻度线, 则可以得到0.2mmol/L、0.4mmol/L、
0.6mmol/L、0.8mmol/L、1mmol/L、1.2mmol/L的溶液。从以上比色管中分别取 0.1ml溶液置于试管中再加入3.9ml的DPPH反应30min,在517nm测出吸光值 (Thoo&Ho,2010),用无水乙醇代替待测液作为对照, 用无水乙醇作空白,重复三 组。
清除率=[(Ac-Ai)/Ac] X 100%
式中,Ac: 0.1 mL无水乙醇加3.9mL DPPH溶液的吸光度;
Ai: 0.1 mL待测液加3.9mLDPPH溶液的吸光度。
323标准曲线的绘制
322测试数据及标准曲线的绘制
0
0
0
1
0.2
0.529
14.92
2
0.4
0.424
30.90
3
0.6
0.32
46.73
4
0.8
0.209
63.62
5
1
0.11
78.69
6
1.2
0.02
92.39
表 3-1 :
VC标准曲线测定数据
口 号
C (mmol/L)
吸光度 清除率/%
以吸光度A为纵坐标,浓度c为横坐标,绘制标准曲线。用最小二乘法进行
线性拟合,得c与A的线性回归方程以及相关系数 氏
图3-1 : VC含量与吸光度的关系
图3-1 : VC含量与清除率的关系
3.2.4 样品的测定
取提液 4ml 至 10ml 的比色管中用 60%的乙醇定容至刻度线则稀释 2.5 倍。
取稀释后溶液O.ImL三份,分别置于10mL试管中,再分别加入配置好的DPPH溶 液3.9mL,摇匀,反应30min后,分别在517nm处测定其吸光度。代入标准曲线 回归方程可得浓度数据(以Vc为参比),三次结果取平均值。经换算后得样品自 由基清除率。
清除ABTS自由基能力的测定
4.1ABTW自由基的配制
准确称取0.19215gABTS于50mL的容量瓶中,用无水乙醇定容,摇匀,浓度 7mmol/L;7mmol/LABTS +.与 2.45mmol/L 的高硫酸钾等体积混合, 在室温、避光 黑暗的条件下静置过夜反应 12~16h,形成ABTS+自由基储备液。该储备液在
室温,避光的条件下稳定。用前用无水乙醇稀释成工作液,于波长 734nm 处测 得其吸光度为0.7000 (± 0.02),再装入棕色试剂瓶中,放入冰箱 4C进行冷藏, 以备用。
标准曲线的绘制
4.2.1参照品Vc标准溶液的制备及测试
准确称取8.8.mgVc到100mL的烧杯中用无水乙醇溶解后,置于50mL的容量 瓶中用无水乙醇定容至刻度线及可以得到 1mmol/L的母液,分别量1、2、3、4、
5、 6、7、8ml至10ml的比色管中用无水乙醇定容至刻度线,则可以得到0.1mmol/L、 0.2mmol/L、0.3mmol/L、0.4mmol/L、0.5mmol/L、0.6mmol/L、0.7mmol/L、0.8mmol/L 的溶液。从以上比色管中分别取 0.1ml 溶液置于试管中再加入 3.9ml 的 DPPH, 反应 30min, 在 517nm 测出吸光值, 用 无水 乙醇 代替待测液作为 对照 (Zhu&Lian,2011) ,用无水乙醇作空白,重复三组。
清除率=[(Ac-Ai)/Ac] X 100%
式中, Ac:0.1 mL 无水乙醇加 3.9mL ABTS+ 自由基溶液的吸光度;
Ai:0.1 mL 待测液加 3.9mLABTS+ 自由基溶液的吸光度。
422测试数据及标准曲线的绘制
■ o 76543 2 100-60.0.0.O.
■ o 76543 2 10
0-60.0.0.O.O.
y=-0,75731+0. 6189
R“2 = 0. 9992
0. 2
0. 4
0. 6
VC Concentration iboI/1
VC Concentration iboI/1
图4-1Vc浓度与其吸光值的关系
y = IIS. 77x-O.OaSTo)00 0 0 0 00 8 6 4 2
y = IIS. 77x-O.OaST
o
)00 0 0 0 0
0 8 6 4 2 警FTPf ML月吕 芯 uTJH&ntAUQ 舄
0.2
0.4 O.S
VC CojlCeiitTati.Oll A*ol/1
o.s
丿序号
C( mmol/l)
吸光度
清除率/%
1
0
0.00
2
0.1
0.57
12.04
3
0.2
0.493
23.92
4
0.3
0.422
34.88
5
0.4
0.351
45.83
6
0.5
0.276
57.41
7
0.6
0.2
69.14
8
0.7
0.118
81.79
9
0.8
0.035
94.60
表4-1 : Vc浓度与吸光值和清除率的数据
图4-2 : Vc浓度与其清除ABTS能力的关系
还原能力的测定
实验试剂 磷酸盐缓冲溶液(配成 PH6.6 0.2mol/l ) ; K 3Fe(CN) 6 溶液(配成 1%);
三氯乙酸(配成 10%);
FeCb (配成 0.1%);
没食子酸 无水乙醇
标准曲线的绘制
试剂的配制
磷酸盐缓冲溶液 (pH6.6 0.2mol/L) :准确称取 7.16g 的磷酸氢二钠至 100mL 的烧杯中用蒸馏水溶解后,置于 100mL 的容量瓶中用蒸馏水定容,即可得到 0.2mol/L 的磷酸氢二钠,同样的方法配制 0.2mol/L 的磷酸二氢钠。准确量取 37.5mL的0.2mol/L磷酸氢二钠溶液和62.5mL的0.2mol/L磷酸二氢钠溶液至烧 杯中,用pH校正既可以得到磷酸盐缓冲溶液(pH6.6 0.2mol/L)。
标准溶液的配制及测试
用没食子酸做标准曲线其浓度范围在 50—300ug/ml,准确称取50mg没食子 酸到100mL烧杯中用无水乙醇溶解后,置于容量瓶中用无水乙醇定容至刻度线, 得到 0.5mg/ml 的母液,在分别取 1mL 2mL 3mL 4mL 5mL 6mL至 10mL的容 量瓶中用无水乙醇定容至刻度先, 得到 50ug/ml 100ug/ml 150ug/ml 200ug/ml 250ug/ml 300ug/ml 的溶液,取不同浓度的待测液或样品 1ml 于试管中,依次 加入PH6.6磷酸盐缓冲溶液(0.2mol/l )2.5ml和1% K3Fe(CN)6溶液2.5ml后 混合均匀,混合液于 50 C水浴 20min,再加入10%的三氯乙酸 2.5ml。于
(3000r/min )离心 10min, 取 2.5ml 的上清液再依次加 2.5ml 蒸馏水和 0.1%的 FeCl3 0.5ml混合均匀,静置10min在700nm处测定吸光值,通过在700nm下的 吸收值来测量提取物的还原能力,吸光值越高表明还原力越强, EC。的计算是吸
光值为 0.5 时的浓度 (Roy&Laskar,2011)。
523测试数据及标准曲线的绘制
gallic acid
Test set
concen trati on ug/ml
Absorbe ncy
1
0
0
2
50
0.59
3
100
1.1
4
150
1.527
5
200
2.073
6
250
2.579
7
300
3.1
表5-1 :没食子酸的质量浓度和吸光值的数据
Gal 丄 ic 心 tmc 亡 ntrHti onug/mL
图5-1 :没食子酸的质量浓度与其吸光值的关系
超氧自由自测定
实验试剂
1 实验试剂
Tris-Hcl 缓冲液(配制 PH8.20 50mmol/L)
邻苯三酚 ( 配制 3mmol/L)
VC
无水乙醇
标准曲线的绘制
6.2..1 试剂的配制
Tris-HCl (pH8.2 50mmol/L )缓冲溶液:取 0.6057g 三羟甲基氨基甲烷
(Tris ),蒸馏水溶解定容至50mL容量瓶;取0.309mL分析纯盐酸溶液至100mL 的容量瓶中用蒸馏水定容至刻度,即得 0.1mol/L 盐酸溶液;分别取配置好的 Tris50mL和0.1mol/L盐酸溶液22.9mL于100mL容量瓶中,蒸馏水定容至刻度, 用pH计进行校正即可以得到Tris-HCl (pH8.2 50mmol/L)缓冲溶液。邻苯三酚: 配制10mmol/L的稀盐酸,取0.310mL分析纯盐酸溶液至1000mL的容量瓶中用蒸 馏水定容至刻度线;取焦性没食子酸 0.0095g,至25mL的容量瓶中用10mmol/L 的稀盐酸溶液定容至刻度线。
6.2.2标准溶液的配置及测试
精密称取 V标准样品0.0300g置于100mL烧杯中,用纯净水溶解后定容至 100mL容量瓶中,即可得0.3mg/mL的Vc标准溶液。
将 0.3mg/mL 的 Vc标准溶液分别配制成 0.0mg/mL,0.03mg/mL,0.06mg/mL, 0.09mg/mL, 0.12mg/mL, 0.15mg/mL, 0.18 mg/mL,0.21 mg/mL,0.24 mg/mL,0.27 mg/mL,0.3 mg/mL的溶液,分别加入 4.5mL 的 Tris-HCl ( pH8.2 50mmol/L)缓冲 溶液于10mL的试管中,再加入1mL不同浓度样品或待测液,25C反应10mi n, 再加入25C预热的邻苯三酚0.1mL (3mmol/L用10mmol/L的盐酸配制),迅速摇 匀,于325nm出测定,加入邻苯三酚即开始计时,每隔 30s读取一次,至5min,
做好记录。邻苯三酚的自氧化速率以无水乙醇代替样品, Tris-HCl 缓冲溶液作 空白。
清除率 %=[(△ Ac- △ Ai)/ △ Ac] x 100%
式中,△ Ac:邻苯三酚自氧化速率;
△ Ai :加入待测液后邻苯三酚自氧化速率
cc-HouM-lJWbouJH
cc-HouM-lJWbouJH
1
/m
g
623测试数据及标准曲线的绘制
吸光值
自氧化速 率
抑制 率
序号
时间min
1st
5th
丿序号
邻苯三酚0.1ml
0.142
0.411
0.06725
1
浓度ug/ml 0
0
0
0
0
2
30
0.032
0.246
0.05350
20.45
3
60
0.015
0.179
0.04100
39.03
4
90
0.012
0.13
0.02950
56.13
5
120
0.007
0.074
0.01675
75.09
6
150
0.006
0.025
0.00475
92.94
表6-1: Vc的质量浓度与吸光值和抑制率的的数据
图6-1: Vc的质量浓度与其清除超氧自由基关系
- 下载文档
- 收藏
- 0
推荐访问:实验报告 绘制 曲线 实验 黄酮标准曲线绘制实验报告