打开文本图片集
摘要：为探讨急性力竭运动对青少年田径运动员血浆游离DNA(cf-DNA)的影响，寻找运动员机能监控的新标记物。安排16名青少年田径运动员在电动跑台上进行一次急性递增负荷力竭运动，于运动前、运动后即刻、运动后15 min、30 min、1 h、2 h、3 h、4 h、12 h和24 h分别测定红细胞压积(HCT)、cf-DNA、血浆丙二醛(MDA)、肌酸激酶(CK)和肌红蛋白(Mb)。用心率表监控运动过程并记录运动时间和心率，推算训练冲量(TRIMPS)。结果显示：HCT在所有监测时间点均无显著性变化(P>0.05)；cf-DNA在运动后即刻显著性升高(P<0.01)，30 min达峰值(P<0.01)，4 h后降至安静水平(P>0.05)；血浆MDA、CK和Mb在运动后即刻均显著性升高(P<0.05、P<0.01、P<0.01)，并一直持续到运动后24 h(P<0.01、P<0.05、P<0.01)。TRIMPS与运动后15 min和30 min时cf-DNA水平呈显著正相关(分别为r=0.55，P<0.01；r=0.64，P<0.05)。结果说明：cf-DNA是组织损伤早期标志物，可作为运动员机能监控的新指标。
关 键 词：运动生物化学；力竭运动；血浆游离DNA；机能监控；运动员
中图分类号：G804.7 文献标识码：A 文章编号：1006-7116(2011)05-0127-05
Effects of acute exhaustive exercising on cell-free plasma DNA of
teenage track and field athletes
WANG Yong1，FU Bo2，ZHU Rong3
（1.School of Physical Education，Weifang University，Weifang 261061，China；
2.Liaoning Center of Football Administration，Shenyang 110081，China；
3.School of Physical Education，Wenzhou Medical College，Wenzhou 325035，China）
Abstract: In order to probe into the effects of acute exhaustive exercising on cell-free plasma DNA of teenage track and field athletes, and to seek for a new marker for athlete performance monitoring, the authors arranged 16 teenage track and field athletes to do an acute exhaustive exercise on a power treadmill, tested their Hematocrit (HCT), Cf-DNA, plasma malondialdehyde (MDA), creatine kinase (CK) and myoglobin (Mb) respectively before exercis-ing, immediately after exercising, at 15 min, 30 min, 1 h, 2 h, 3 h, 4 h, 12 h and 24 h after exercising, monitored the exercising process with a heat rate meter, recorded their exercising times and heart rates, calculated their exercising impulses (TRIMPS), and revealed the following findings: there was no significant change to HCT at all test times (P>0.05); cf-DNA increased significantly immediately after exercising (P<0.01), reached the peak value at 30 min (P<0.01), and lowered to the calm level at 4 h (P>0.05); plasma MDA, CK and Mb increased significantly immedi-ately after exercising (P<0.05, P<0.01, P<0.01), and maintained up to 24 h after exercising (P<0.01, P<0.05, P<0.01); TRIMPS was positively correlative significantly with the cf-DNA level at 15 min and 30 min after exer-cising (r=0.55, P<0.01 and r=0.64, P<0.05 respectively). The said findings indicated that cf-DNA is an early marker for tissue damage, can be used as a new index for athlete performance monitoring.
Key words: sports biochemistry；exhaustive exercise；cell-free plasma DNA；performance monitoring；athlete
机能监控是运动训练的关键组成部分，是运动员取得良好训练效果和优异比赛成绩的重要保障。科研人员和教练员不断探索新的方法和标记物，以便更科学地监控运动训练[1-2]。近年来，由于PCR及其相关分子生物学技术的发展，可在体液中定量并分析含量极少的游离DNA，称为循环DNA(circulation DNA)，即存在于血浆或血清、脑脊液及滑膜液等体液中的细胞外DNA，其中存在于血浆中的游离DNA称为血浆游离DNA(cell-free plasma DNA，cf-DNA)[3-4]。凋亡以及坏死细胞的DNA释放入血即形成cf-DNA，它已成为临床医学中多种疾病(包括肿瘤、创伤、妊娠相关疾病、感染性疾病、心肌梗死等)早期诊断、病情监测、疗效及预后评估的一种重要的分子标志物[3-4]。由于cf-DNA是一项无创性检测指标，因此有望在运动医学中得到应用。本研究旨在探讨一次急性力竭运动对青少年田径运动员cf-DNA的影响，同时将其与传统机能监控指标丙二醛(malondialdehyde，MDA)、肌酸激酶(creatine kinase，CK)和肌红蛋白(myoglobin，Mb)进行比较，以期寻找运动员机能监控的新的敏感标记物。
1 研究对象与方法
1.1 研究对象
16名温州体育运动学校的男子田径运动员自愿参加本实验，年龄(11.6±2.6)岁，身高(1.74±0.14) cm，体重(68.6±5.4) kg，训练年限(4.1±0.8)年。所有运动员身体健康，无心血管疾病、急慢性感染、骨关节疾病及其他疾病史，无吸烟、饮酒等不良嗜好。
1.2 运动方案
实验前72 h内受试者均未进行过剧烈运动，实验前一晚至少睡眠8 h。清晨空腹采静脉血5 mL后休息15 min，然后在电动跑台上进行递增负荷实验，起始负荷为5 km/h，持续3 min，之后每3 min递增1 km/h，直至力竭。整个过程用遥测心率表(Polar，S810，芬兰)记录心率和运动时间。运动后即刻以及运动后(休息) 15 min、30 min、1 h、2 h、3 h、4 h、12 h和24 h静脉采血5 mL，EDTA抗凝。
1.3 运动负荷的量化——训练冲量(TRIMPS training
impulses)
采用Banister等[5-6]提出的计算运动冲量的方法，公式为：运动冲量=D×X×K。其中，D=运动时间(min)，X=训练强度=(运动时平均心率－安静心率)/(最高心率－安静心率)，K=训练强度加权指数=eαx(e为欧拉常数，是自然对数的底≈2.718 28；α=1.92)。
运动时间、安静心率、运动时平均心率和最高心率均可通过心率表获得。
1.4 MDA、CK和Mb的测定
取300 μL全血，测定HCT(红细胞压积)(全血分析仪，MICROS60，美国)；其余全血在低温下(4 ℃)离心15 min(3 000 r/min)，取血浆测试各生化指标。MDA、CK和Mb使用试剂盒(南京建成生物工程研究所)并严格按照操作说明进行，测试仪器：MD-100半自动生化分析仪(日本)。
1.5 cf-DNA的测定[7-8]
1)血浆DNA提取和纯化。
取离心后的血浆400 μL，严格按照QIAamp DNA Blood Mini Kit(Qiagen，德国)的操作步骤进行cf-DNA的提取，然后用50 μL双蒸水(不含RNA酶和DNA酶)进行洗脱。
2)cf-DNA定量分析。
取10 μL cf-DNA置于透明载板，与1︰3 000荧光染料SYBR green I等比例稀释并充分混匀后置于紫外及可见光成像分析系统(Bio-Rad，美国)中，在激发光波长为345 nm、吸收波长500 nm条件下，读取其发光强度。将检测所得不同样本DNA的发光强度代入根据标准含量DNA的发光强度所作的回归方程中，分别计算相应的DNA质量浓度。如果样本发光强度超过标准DNA发光强度范围，则将样本稀释后再进行定量检测，直到所测值在标准质量浓度范围内。每次对同一血浆样本检测3次，取其平均值，单位为pg/μL。
1.6 统计方法
所有数据用均数±标准差表示，指标各时间点的比较采用重复测量的方差分析，两两比较采用Bonfferoni检验。对TRIMPS和cf-DNA进行简单相关分析并计算Pearson相关系数®。P<0.05为显著性水平，P<0.01为非常显著水平。用SPSS 14.0统计软件进行数据处理。
2 结果及分析
2.1 各指标的时程变化
HCT在所有监测时间点均无显著性变化(P>0.05)(图1)，因此，运动干预与取血测试并没有造成机体的明显血浆丢失和血液浓缩，所有浓度指标均可较为准确反映其实际变化。
cf-DNA在运动后即刻显著性升高(P<0.01)，30 min达峰值(P<0.01)，随后逐渐下降，运动后3 h仍高于基础水平(P<0.01)，运动后4 h降至基础值(P>0.05)，并一直维持到24 h(P>0.05)(图2)。
MDA在运动后即刻明显升高(P<0.05)，随后继续升高，并在运动后24 h出现峰值(P<0.01)(图3)。
CK的变化与MDA相似，即运动后即刻升高(P<0.01)，运动后24 h出现峰值(P<0.05)(图4)。
Mb在运动后即刻升高(P<0.01)，运动后4 h出现峰值(P<0.05)，随后逐渐下降，但在运动后24 h仍高于基础水平(P<0.01)(图5)。
2.2 相关分析
相关分析显示，TRIMPS与运动后15 min和30 min时cf-DNA水平呈显著正相关(分别为r=0.55，P<0.01；r=0.64，P<0.05)。运动之前与其他的时间点相关均无显著性。
3 讨论
剧烈运动时肌肉暂时性缺血，运动后恢复期血流再灌注(缺血-再灌注)，可出现细胞内钙超载、炎症细胞浸润以及自由基产生增多，继而发生DNA的氧化损伤和降解[9-10]。同时，运动还通过机械作用造成肌纤维的损伤，表现为肌痛、无力、血清肌肉蛋白升高等。上述代谢机制和机械机制可导致肌细胞的凋亡甚至坏死[11]。本研究中MDA在运动后显著性升高，证实机体产生自由基增多；运动后CK、Mb升高，表明肌细胞受到运动诱导的缺血再灌注损伤使其破坏增加[12]，其原因可能是自由基攻击DNA、蛋白质和脂质(特别是膜的脂质双层)，从而产生氧化损伤所致[13]。DNA损伤(核苷酸氧化、双链断裂或DNA交联)后“事件”为DNA缺陷修复、凋亡和坏死[14-15]。DNA缺陷修复会造成DNA序列发生改变，引起代谢紊乱甚至癌症[16]。非特异性DNA修复酶切除损伤部位并释放DNA片段[17]，碱基特异性的修复酶切除相应的碱基[18]，这些产物释放入血形成cf-DNA。
cf-DNA最早发现于癌症患者的血循环中[19]，随后证实与多种临床疾患相关联。因此，cf-DNA已成为预测和诊断多种疾病的分子标志物。例如，创伤后发生多器官功能紊乱综合征的患者往往在创伤发生15~30 min后cf-DNA即显著升高，并持续数天；而无创伤并发症的患者cf-DNA往往出现较晚、升高幅度较低、持续时间较短[20]。癌症患者基因发生突变，血液中出现相应的突变DNA、癌基因扩增产物以及肿瘤相关的病毒DNA[21]。尽管cf-DNA与疾病关系的具体机制尚不明确，但诸多研究已证实，cf-DNA来自于凋亡或坏死的组织细胞[4]。在本研究中，力竭运动后cf-DNA急剧增加同时伴随血清CK与Mb升高，提示骨骼肌细胞凋亡、DNA片段的释放可能是cf-DNA的主要来源，但不是唯一来源。一些研究表明，运动后发生凋亡的肾小管细胞[22]和白细胞[23]均是cf-DNA的来源。因此，运动后cf-DNA的升高是多种类型细胞凋亡的结果。
cf-DNA在运动后的时程变化规律罕有报道。Atamaniuk等[23]观察了一次力量训练对cf-DNA的影响，结果发现训练后即刻cf-DNA显著升高，2 h后显著下降；Fatouros等对17名普通人进行为期12周的力量训练干预，cf-DNA在训练后72 h仍高于安静水平。这可能与不同的研究对象、运动方式、运动周期和测试时间等有关，但上述研究未检测运动后即刻至运动后2 h这段时间内cf-DNA的变化。
本研究以田径运动员为受试对象，采用力竭运动模型，运动后的测量时间点较为密集，从而揭示了cf-DNA在力竭运动后的变化规律。cf-DNA在运动后即刻显著升高，30 min达峰值，随后逐渐下降，运动后3 h仍高于基础水平，运动后4 h降至基础值，时间上比Atamaniuk等的研究结果稍滞后，可能与本研究所采用的力竭模型有关。cf-DNA在运动后即迅速消除，这与传统机能监控指标MDA、CK和Mb在运动后显著升高并一直持续到24 h的时程变化规律不同，可能与肝脏和肾脏对cf-DNA的快速代谢有关[4]，也可能是降解的DNA片段从凋亡或坏死细胞释放入血的机制不同[23]，具体原因尚不清楚。上述现象提示cf-DNA可能是监测肌细胞损伤的早期、敏感、特异的预测与监控指标。
TRIMPS与cf-DNA正相关，说明cf-DNA除了可用于监测身体机能状态，还能反映训练负荷，即负荷越大，cf-DNA水平越高，可能是不同训练负荷造成机体损伤程度不同所致。Lo等[24]和Rainer等[25]分别证实了创伤与中风患者组织损伤的程度与cf-DNA呈正相关关系，本研究在一定程度上也验证了上述结论。TRIMPS与运动后30 min cf-DNA的相关系数最高(r=0.64)，而且cf-DNA在运动后4 h迅速消退，提示训练后的测试时间是一个关键因素，因此用此指标监控训练负荷时，应在运动后30 min左右取血测定较为合理。
本研究探讨了力竭运动后cf-DNA的变化规律以及与训练负荷的关系，但仍有诸多问题尚未解决。今后的研究需要进一步探讨运动诱导的cf-DNA的细胞来源和具体机制，不同运动方式、不同竞技项目以及不同机能状态对cf-DNA的影响，揭示cf-DNA对运动反应和适应的规律，从而为运动员机能监控提供敏感、无创的标志物，为运动员取得良好训练效果和优异比赛成绩提供科研保障。
cf-DNA是组织的损伤早期标志物，可作为运动员机能监控的新指标，但其时程变化规律不同于MDA、CK和Mb等传统指标。
参考文献：
[1] 何子红，胡扬. 体能训练个性化新指标——基因标记[J]. 中国运动医学杂志，2010，29(5)：597-606.
[2] 郭兴明，杨勇，肖守中，等. 运动员心功能评估新方法和新指标的研究[J]. 中国应用生理学杂志，2010，26(3)：380-383.
[3] 孙群，王德生. 游离DNA与临床肿瘤的研究进展[J]. 医学综述，2010，16(9)：1348-1350.
[4] Saukkonen K，Lakkisto P，Pettila V，et al. Cell-free plasma DNA as a predictor of outcome in severe sepsis and septic shock[J]. Clin Chem，2008，54(6)：1000-1007.
[5] Banister E W，Calvert T W. Planning for future per-formance：implications for long term training[J]. Can J Appl Sport Sci，1980，5(3)：170-176.
[6] Manzi V，Castagna C，Padua E，et al. Dose-response relationship of autonomic nervous system responses to individualized training impulse in marathon runners[J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol，2009，296(6)：H1：733-1740.
[7] 刘丽荣. 上皮性卵巢癌患者血浆中的cDNA水平变化及意义[J]. 山东医药，2010，50(34)：93-94.
[8] 今毅，郑晖，韩冰. 循环DNA定量分析在乳腺癌诊断中的应用[J]. 微循环学杂志，2007，17(4)：62-63.
[9] Wohlgemuth S E，Seo A Y，Marzetti E，et al. Skeletal muscle autophagy and apoptosis during aging: effects of calorie restriction and life-long exercise[J]. Exp Geron-tol，2010，45(2)：138-148.
[10] 张桂忠，姜宁，张勇. 急性运动中骨骼肌线粒体氧化应激机制研究[J]. 内蒙古师范大学学报：自然科学汉文版，2009，38(3)：337-340.
[11] Brancaccio P，Lippi G，Maffulli N. Biochemical markers of muscular damage[J]. Clin Chem Lab Med，2010，48(6)：757-767.
[12] Goodman C，Hey G，Dawson B，et al. Bio-chemical and ultrastructural indices of muscle damage after a twenty-one kilometre run[J]. Aust J Sci Med Sport，1997，29(4)：95-98.
[13] Guachalla L M，Rudolph K L. ROS induced DNA damage and checkpoint responses：influences on ag-ing?[J]. Cell Cycle，2010，9(20)：4058-4060.
[14] Chevion S，Moran D S，Heled Y，et al. Plasma antioxidant status and cell injury after severe physical exercise[J]. Proc Natl Acad Sci U S A，2003，100(9)：5119-5123.
[15] Ogonovszky H，Berkes I，Kumagai S，et al. The effects of moderate-strenuous-and over-training on oxi-dative stress markers，DNA repair，and memory，in rat brain[J]. Neurochem Int，2005，46(8)：635-640.
[16] Fehrenbach E，Northoff H. Free radicals，exercise，apoptosis，and heat shock proteins[J]. Exerc Immunol Rev，2001，7：66-89.
[17] Kruger K，Frost S，Most E，et al. Exercise affects tissue lymphocyte apoptosis via redox-sensitive and Fas-dependent signaling pathways[J]. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol，2009，296(5)：R1518-1527.
[18] Lesher D T，Pommier Y，Stewart L，et al. 8-Oxoguanine rearranges the active site of human topoi-somerase I[J]. Proc Natl Acad Sci U S A，2002，99(19)：12102-12107.
[19] Leon S A，Shapiro B，Sklaroff D M，et al. Free DNA in the serum of cancer patients and the effect of ther-apy[J]. Cancer Res，1977，37(3)：646-650.
[20] Lam N Y，Rainer T H，Chan L Y，et al. Time course of early and late changes in plasma DNA in trauma pa-tients[J]. Clin Chem，2003，49(8)：1286-1291.
[21] 杨英俊，陈辉. 循环DNA的临床应用[J]. 生命的化学，2009，26(6)：822-825.
[22] Podhorska-Okolow M，Dziegiel P，Murawska-Cialowicz E，et al. Exercise-induced apop-tosis in renal tubular cells of the rat[J]. Folia Morphol (Warsz)，2004，63(2)：213-216.
[23] Atamaniuk J，Stuhlmeier K M，Vidotto C，et al. Effects of ultra-marathon on circulating DNA and mRNA expression of pro-and anti-apoptotic genes in mononu-clear cells[J]. Eur J Appl Physiol，2008，104(4)：711-717.
[24] Lo Y M，Rainer T H，Chan L Y，et al. Plasma DNA as a prognostic marker in trauma patients[J]. Clin Chem，2000，46(3)：319-323.
[25] Rainer T H，Wong L K，Lam W，et al. Prognostic use of circulating plasma nucleic acid concentrations in patients with acute stroke[J]. Clin Chem，2003，49(4)：562-569.