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摘要：为研究XTH基因与棉花（Gossypium spp.）纤维伸长的关系，克隆了两个XTH基因，分别命名为GhXTH1（GenBank：AY189971）和GhXTH2（GenBank：JN968478）。GhXTH1编码区全长870 bp，编码289个氨基酸，GhXTH1全长885 bp，编码294个氨基酸。序列分析表明，GhXTH1和GhXTH2均存在XTH家族保守序列DEIDFEFLG。生物信息学分析表明，GhXTH1和GhXTH2均含有信号肽。跨膜结构预测表明，GhXTH1和GhXTH2均在N端存在跨膜螺旋。系统发生学分析表明，GhXTH1与拟南芥XTH6、XTH7亲缘关系较近，GhXTH2与拟南芥XTH9亲缘关系较近。半定量分析表明，GhXTH1和GhXTH2均随着棉花纤维发育表达量降低，GhXTH2比GhXTH1表达量高。
关键词：棉花（Gossypium spp.）纤维；木葡聚糖转移/水解酶；克隆；表达分析；伸长
中图分类号：S562；Q78 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）04-0756-06
棉花（Gossypium spp.）纤维是由胚珠表皮细胞发育而来，成熟纤维细胞长度可为其直径的1 000～3 000倍，有的可达35～40 mm[1]。海岛棉（Gossypium barbadense，Gb）成熟棉纤比陆地棉（Gossypium hirsutum，Gh）长，但在开花后24 d，陆地棉纤维长度比海岛棉纤维长[2]。棉纤维细胞的伸长开始于开花当天[3-5]，纤维细胞伸长速率最大的阶段发生在开花后6～12 d和15～20 d，两个阶段伸长量可达最终长度的80%[6]。
棉纤细胞伸长由细胞内膨压驱动，并伴以细胞壁松弛过程。细胞内渗透溶质增加，促进细胞内渗透压增加，使细胞吸收大量水分，从而使细胞膨压增加，使细胞渗透压增加的溶质主要是可溶性糖、苹果酸盐及鉀离子（K+）[7]。磷酸丙酮酸羧化酶（PEPC）[8]、胞间连丝[9，10]、蔗糖酶（Vacuelar invertase）[11]、水通道蛋白[12]与棉纤细胞膨压产生或增加有关。
棉纤细胞壁是由纤维素、半纤维素和结构蛋白组成的动态网络。半纤维素木葡聚糖是植物细胞初生壁的结构多糖，木葡聚糖链通过共价氢键绑附到纤维素链上，将临近纤维素微纤丝交联起来[13]。微纤丝之间木葡聚糖交联结构是细胞伸长的主要限制因素之一。该交联结构可以被木葡聚糖转移/水解酶（Xyloglucan endotransglucosylase/Hydrolase，XTH）解开并重新连接，从而降低细胞伸长的阻力，因此XTH能通过松弛细胞壁进而促进细胞伸长。重组拟南芥（Arabidopsis thaliana，At）XTH14和XTH26加到根系上，展现出对根系细胞伸长明显的促进作用[14]。在拟南芥中，超表达AtXTH18、AtXTH19、AtXTH20能刺激下胚轴伸长[15]；在棉花中，超表达GhXTH1能增强XTH活性，使棉花纤维长度增加15%～20%[16]。XTH基因在棉花纤维中表达存在时间特异性和品种特异性[17]，在海岛棉和陆地棉花棉花纤维中表达存在差异[18]。XTH基因表达模式与棉花纤维长度存在关联。
本研究从陆地棉中克隆分离两个XTH基因，对其进行序列分析、系统发生学分析和表达分析，以期为了解XTH基因及其家族与棉花纤维伸长之间的关系奠定基础，从而为棉花纤维品质改良特别长度品质改良提供候选基因。
1 材料与方法
1.1 试验材料
所用的棉花材料为陆地棉珂字201、华棉99，海岛棉为军海1号。分别取开花后4、9、14、19、24 d棉瓣放入液氮，然后存入-80 ℃冰箱备用。大肠杆菌（Escherichia coli）菌株DH5α为实验室保存，中间载体pMD18-T购于宝生物工程（大连）有限公司。
1.2 总RNA的提取与cDNA的合成
棉花纤维总RNA用热硼酸法提取[19]，并按DNase I试剂盒所示方法处理总RNA，以去除其中DNA，然后用15 μL DEPC ddH2O溶解，分光光度计测定RNA浓度。最后按照Promega反转录酶体系进行操作，合成第1链cDNA，反转录后的cDNA保存于-20 ℃。
1.3 GhXTH1和GhXTH2克隆
在NCBI中有一个XTH全长编码序列（AY189971），另外还存在一个EST序列（DV848907）。对于AY189971，根据其全长序列，从两端设计引物（GhXET-OE-F：5′-AAAGTCGACATTCTCTTTCTGTTTCTCTGGTTTA-3′；GhXET-OE-R：5′-AAAGGTACCTCAGATGATGGACATGCACTC-3′），以14 d棉花纤维cDNA为模板，PCR扩增后测序。对于DV848907，将其与AtXTH序列比对，发现该段EST序列与AtXTH基因5′端同源程度较高，而且同源区包含起始密码子。根据此段EST序列设计引物进行3′RACE（Rapid-amplification of cDNA ends），测序得到一段DNA序列，以该序列与EST序列拼接翻译，发现以EST序列的第三个碱基开始翻译能翻译出一个完整蛋白序列。在该序列内存在两个起始密码子，以第一个起始密码子翻译到蛋白序列长度相对符合XTH蛋白序列长度。RACE方法见参考文献[20]。
1.4 GhXTH生物信息学分析
利用ClustalW软件进行多序列对齐和排序， 使用GenDOC和MEGA5.0软件输出同源比对和进化树构建结果[21]；用SingaIP进行信号肽预测[22]；用ProtParam计算蛋白质的相对分子质量和理论等电点[23]；利用TMHMM预测蛋白质的跨膜结构域。