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摘要：亚硝酸盐含量是涉及食品安全的重大问题。采用紫外-可见分光光度法分析青菜、生菜、黄瓜等三种常见蔬菜在煮熟后放置不同温度环境下贮存并分时取样，使用盐酸萘乙二胺定量测量样品中亚硝酸盐浓度。结果表明，室温环境下青菜、生菜中亚硝酸盐含量增加显著，冷藏保存的样品亚硝酸盐浓度则较低，而黄瓜样品的亚硝酸盐含量则极少。后续可从微生物角度进一步探究亚硝酸盐产生的机理。
关键词：亚硝酸盐;紫外-可见分光光度法;食品安全;制熟蔬菜
文章编号：1008-0546（2018）12-0093-03 中图分类号：G633.8 文献标识码：B
doi：10.3969/j.issn.1008-0546.2018.12.031
亚硝酸盐是一种对人体健康危害极大的物质，它可使血液中血红蛋白转化成高铁血红蛋白，使血红蛋白失去携氧能力，致使组织缺氧，引起急性中毒;还能与体内仲胺类化合物作用生成致癌性很强的N—亚硝基化合物。随着人们生活水平和食品安全意识的提高，食品中的亚硝酸盐含量越来越受到关注。特别是“剩菜中的亚硝酸盐”这一话题。本文选取日常生活中常见的三种蔬菜进行实验，加入家用自来水加热煮熟（未加入食用盐）后研究其中亚硝酸盐浓度的变化与存放时间、存放条件的关系，旨在以科学视角分析看待食品安全问题，以便对生活中的化学问题有更科学的了解，为人们形成健康理性的生活方式提供初步指导。
一、研究内容和方法
本实验选取青菜、生菜、黄瓜三种常见蔬菜，在家常环境下加入家用自来水煮熟，分别存放在20℃室温条件下和4℃冷藏环境下，在贮存12h、35h、58h时取样检测，观察测定煮熟蔬菜中的亚硝酸盐浓度随存放时间和条件的变化关系。
本实验运用国标规定的盐酸萘乙二胺法 [1]，盐酸萘乙二胺与亚硝酸钠标准溶液及样品反应后使用紫外-可见分光光度计测量溶液吸光度，利用数据拟合等手段，得出标准溶液曲线，计算出样品中的亚硝酸盐精确浓度。再通过分析同种蔬菜中亚硝酸盐含量随存放时间、存放条件的变化，以及相同条件下不同蔬菜中亚硝酸盐含量的差异，得出关于煮熟蔬菜中亚硝酸盐含量变化的初步结论。
紫外-可见分光光度计的工作原理基于朗伯-比耳定律：A=εbc，其中A为吸光度，ε为摩尔吸光系数，b为液池厚度，c为溶液浓度。不同分子吸收紫外可见辐射光后发生电子能级跃迁而产生特有的吸收光谱，根据其特征波长处的吸光度可以测定该物质的浓度。本实验使用的岛津UV-2700紫外-可见分光光度计为通用型研究级的分光光度计，杂散光透过率0.000001%，其精度完全满足本文研究需要。
二、研究材料和步骤
1.试剂与仪器
试剂：超纯水（如无特殊说明，实验所用水均为超纯水）、乙酸锌、KOH溶液、活性炭粉末、对氨基苯磺酸、盐酸萘乙二胺、亞硝酸钠、稀盐酸。
仪器：岛津UV-2700紫外-可见分光光度计、电子天平、移液枪及枪头、50mL康宁离心管、离心管架、食品料理机、烧杯、一次性注射器、水相针式滤器、电子pH计、70℃恒温水浴锅、药匙。
2.样品制备
取市售青菜、生菜、黄瓜进行实验。在家常环境下将蔬菜洗净，加入家用自来水煮熟（未加入食盐），即制得家常食用的菜汤。使用食品料理机将3种菜汤分别碾成匀浆。取6个50mL的康宁离心管，每个管中加入40mL的蔬菜匀浆，每种蔬菜取6管，共得18份样品。将每份样品编号为“λm-n”，其中λ=A或B或C，代表蔬菜种类，A表示青菜，B表示生菜，C表示黄瓜;m=0或1，代表贮存条件，0表示4℃冷藏，1表示室温条件;n=1或2或3，代表取样次数，即第n次取样。其中，样品制备12h后进行第一次取样测试，35h后第二次取样，58h后第三次取样。
3.溶液配制
亚硝酸钠储备液：0.1g/L，可由5g/L溶液稀释得到。称取0.25g亚硝酸钠固体，加入50mL康宁离心管中，加水定容到50mL，充分溶解。随后用移液枪吸取1mL溶液加入50mL康宁离心管，加水定容到50mL，摇匀，即得0.1g/L亚硝酸钠储备液。
亚硝酸钠标准溶液：0.02mg/L，0.05mg/L，0.1mg/L，0.5mg/L，1mg/L。分别吸取0.01mL，0.025mL，0.05mL，0.25mL，0.5mL储备液于50mL康宁离心管中，加水定容到50mL，混匀，即得一系列亚硝酸钠标准溶液。
4%乙酸锌溶液：称取2g乙酸锌固体于50mL康宁离心管中，加水定容到50mL，充分溶解。此溶液可一次配制多份备用。
对氨基苯磺酸溶液：称取0.2g对氨基苯磺酸固体于50mL康宁离心管中，加水定容到50mL，充分溶解，用铝箔纸包裹，避光保存。
0.2%盐酸萘乙二胺溶液：称取0.1g盐酸萘乙二胺固体于50mL康宁离心管中，加水定容至50mL，充分溶解，备用。
4.样品提取
称取10.0g匀浆于康宁管中，加入25mL4%乙酸锌溶液，用2mol/L KOH溶液调pH=7.2～7.5。再加1g活性炭粉末，混匀，于70℃水浴中加热30min，冷至室温。将试样加水定容至50mL，摇匀，静置10min后使用一次性注射器吸取，通过水相针式滤器过滤，滤液待测。此滤液中样品浓度为0.2kg/L。
5.使用紫外-可见分光光度计测试
（1）标准曲线的绘制
按浓度由低到高的顺序依次取2mL亚硝酸钠标准液于离心管，加入1mL对氨基苯磺酸溶液，混匀。5min后加入1mL 0.2%盐酸萘乙二胺溶液，用1mol/L
HCl溶液调pH=1.2±0.1。加水定容至10mL刻度。使用紫外-可见分光光度计在538nm处测吸光度。采集吸光度数据为自变量，以标准溶液浓度为因变量，计算，绘制亚硝酸钠标准曲线图像。
（2）样品测试
取2mL滤液于离心管，加入1mL对氨基苯磺酸溶液，混匀。5min后加入1mL 0.2%盐酸萘乙二胺溶液，用1mol/L HCl溶液调pH=1.2±0.1。加水定容至10mL刻度。使用紫外-可见分光光度计在538nm处测吸光度。待测液中样品浓度为0.04kg/L。采集吸光度数据，代入标准曲线方程，算出对应的待测溶液浓度。其单位为mg/L，故读出数据换算为样品原液的单位为“×25mg/kg”（下文的数据已经过换算）。
三、研究结果与分析
1.实验数据
测得实验数据如表1所示。
根据实验数据绘制变化曲线如图1所示。
2.数据分析与讨论
由实验数据分析可以得出：
（1）对于青菜、生菜，在室温环境下贮存的样品在相同时间内亚硝酸盐含量普遍高于4℃冷藏环境，且随着贮存时间的增加，室温条件下的样品亚硝酸盐浓度递增，贮存35h及以上时比冷藏贮存的样品高出3个数量级;冷藏贮存对于青菜、生菜等室温下易产生高浓度亚硝酸盐的样品而言效果显著。
黄瓜样品无论是冷藏保存还是室温保存的，亚硝酸盐浓度58h内一直处于极低水平。据现有研究的一般结论认为，瓜果类蔬菜与叶类蔬菜相比，无论是否烹饪煮熟，其亚硝酸盐含量均明显较低。本实验通过水煮制熟方式观测其亚硝酸盐含量变化，进一步支持了已有相关研究的结论。
（2）对于青菜样品冷藏保存使得亚硝酸盐浓度在12h左右达到小峰值，在12h到35h之间快速下降;而冷藏的生菜样品中的浓度一直保持低水平;常温保存的青菜、生菜样品的亚硝酸盐含量则持续大幅增加;黄瓜样品亚硝酸盐含量一直极低。结果表明，不同种类的蔬菜样品在不同条件下的亚硝酸盐含量与贮存时间似乎没有显著的线性关联关系，对于其中的原因，下一步將考虑从微生物群落的变化入手进行探究。
（3）青菜、生菜等叶类蔬菜似乎更容易产生亚硝酸盐，而黄瓜即使长时间放置产生的亚硝酸盐含量也很少。下一步深入探究可以从微生物角度探析亚硝酸盐的产生机理，也可以再研究多种不同类型蔬菜，以获取更大的样本信息。
四、结论及对食品安全的启示
尽管实验数据有所差异，但从特殊中把握一般，可以初步得出结论：对于制熟的蔬菜，冷藏贮存的蔬菜中亚硝酸盐含量一般低于室温贮存的，贮存时间超过一天的尤其明显;叶类蔬菜产生亚硝酸盐的剂量比瓜果蔬菜高很多;长时间贮存的蔬菜具有亚硝酸盐含量较高的风险。
根据国标GB2762—2005 [2]的规定，蔬菜中亚硝酸盐限量为4mg/kg;国标GB2762—2017 [3]规定，腌渍蔬菜中亚硝酸盐限量为20mg/kg。按此标准，室温放置一天以上的生菜、青菜中的含量均已严重超标，冷藏12h的青菜也处于风险范围。据此，本实验可以对生活中的食品安全给出初步的参考：保留食用的“剩菜”应当放入冷藏，保存的时间也不宜过长;尽量当天食用做熟的蔬菜，以确保安全。
（本文为中学生科技创新后备人才培养计划（英才计划）的研究成果。）
参考文献
[1] 中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会，国家食品药品监督管理总局.GB5009.33—2016食品安全国家标准食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定[M].北京：中国标准出版社，2016
[2] 中华人民共和国卫生部，中国国家标准管理委员会.GB2762—2005食品中污染物限量[M].北京：中国标准出版社，2005
[3] 中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会，国家食品药品监督管理总局.GB2762—2017食品安全国家标准食品中污染物限量[M].北京：中国标准出版社，2017